浓香型白酒作为我国优势传统发酵食品的典型代表，风格独特，深受消费者青睐，其产销量均占中国白酒行业的主导地位。在酿造过程中，酒醅是微生物发酵的主要载体和白酒呈香物质的直接来源，因此，研究酒醅活性微生物菌群的多样性、代谢特征及相互作用等是阐明浓香型白酒固态发酵机制及风味物质溯源的关键环节。
近年来，在RNA水平上进行的宏转录组学技术被不断运用于微生物群落研究，宏转录组学是后基因组时代最具代表性的新技术，通过对特定时期、特定环境样品中所有微生物群落的RNA转录本进行大规模测序，可以直接获得环境中可培养和不可培养的微生物转录组信息，能真实地反映出活性微生物状态及其动态变化。以RNA为基础的宏转录组等分子生物学研究则能帮助更好地了解浓香型白酒发酵过程中活性微生物群落的特征及变化，而提取的总RNA质量好坏对后续的研究结果影响较大。
郑州轻工业大学食品与生物工程学院的胡晓龙、王康丽和宋丽丽等人建立了一种改良的SDS-苯酚法，并从提取成本及耗时、RNA质量浓度和纯度、电泳结果、反转录效果及高通量测序分析5个方面比较其与目前常规的4种RNA提取方法提取浓香型白酒酒醅总RNA的效果，包括试剂盒法、Trizol法、CTAB法和月桂酸钠法。
1总RNA质量浓度及纯度、成本及耗时分析
结果显示，5种方法均能提取到酒醅样品中总RNA，其中试剂盒法提取的总RNA平均质量浓度最高（.8ng/μL），分别为SDS-苯酚法（.6ng/μL）、Trizol法（ng/μL）、CTAB法（.65ng/μL）和月桂酸钠法（62.2ng/μL）的1.84、2.33、19.14倍和3.09倍。5种方法所得总RNA样品的ODnm/ODnm存在较大差异，其中SDS-苯酚法和试剂盒法提取的酒醅总RNA的ODnm/ODnm均大于2.0，表明这两种方法所提取出的酒醅总RNA中多糖、酚类、腐殖酸和有机溶剂等物质的污染较小，纯度高。而Trizol法、CTAB法和月桂酸钠法提取的酒醅总RNA样品的ODnm/ODnm远小于2.0，其平均值分别为0.29、1.10和0.58，表明这3种方法所提取的RNA样品中存在多糖、酚类、腐殖酸或有机溶剂等物质的污染现象，纯度较差，尤其是CTAB法所提RNA样品纯度最差，进而会对后续分子实验（如real-timePCR、RT-PCR及电泳分析等）产生不同程度的干扰。SDS-苯酚法和Trizol法所提取酒醅总RNA的ODnm/ODnm均在1.8～2.0之间，表明这两种方法所提取的RNA样品中蛋白质污染较小，纯度较好。试剂盒法所提取的酒醅总RNA的ODnm/ODnm大于2.0，表明该方法所提取的总RNA有降解发生。CTAB法和月桂酸钠法提取的酒醅总RNA样品的ODnm/ODnm均较低，表明RNA样品中存在蛋白质等物质的污染，纯度较差。从提取每个酒醅样品总RNA所需要试剂的费用进行比较，SDS-苯酚法和CTAB法成本最低，试剂盒法成本最高，提取一次RNA的费用约49元。5种方法提取RNA耗时在3.5～5h之间，试剂盒法耗时最短，其余方法在5h左右。
2总RNA完整性分析
如图1所示，采用同种方法提取两种酒醅所得RNA的电泳条带无明显差异，但不同方法所提RNA亮度差异较大，试剂盒法和SDS-苯酚法所提取的RNA条带亮度明显亮于Trizol法，CTAB法未检测到条带，这也与RNA质量浓度检测结果一致。SDS-苯酚法提取酒醅总RNA中23S和16S条带清晰整齐，5S条带不明显，其中23S条带亮度与16S基本一致，说明RNA完整性较好。试剂盒法提取酒醅总RNA23S和16S条带模糊不整齐，电泳条带弥散，整体提取效果一般。Trizol法提取酒醅总RNA23S和16S条带不够清晰完整，5S条带明显，略有拖带，表明RNA部分降解、有杂质污染，提取效果一般。月桂酸钠法提取酒醅总RNA仅有5S条带清晰可见且不规整，表明RNA降解严重，完整性差。
3RT-PCR检测分析
采用RT-PCR实验进一步分析上述方法所得总RNA的完整性及用于后续分子生物学实验的可行性，结果如图2所示。除CTAB法、月桂酸钠法外，SDS-苯酚法、试剂盒法和Trizol法代表的6个泳道均出现了目的条带，表明这3种方法所提RNA均能有效地进行反转录实验，条带大小在bp左右，与预期结果一致；结合RNA纯度的分析结果，3种方法所提取的总RNA基本无蛋白质污染，同时总RNA质量浓度高，对后续RT-PCR影响不大。但Trizol法提取总RNA的ODnm/ODnm偏低，考虑会对后续分析结果有影响，将进一步结合高通量测序结果进行分析。
4高通量数据分析
根据RT-PCR结果，本研究选取了SDS-苯酚法、试剂盒法和Trizol法所提取的RNA反转录后的cDNA样本用于高通量测序16SrRNA，结果表明，3种方法提取的RNA对结果的影响存在差异。如图3A所示，SDS-苯酚和试剂盒法结果相似，即发酵7d酒醅OTU数量均高于15d的酒醅，与Trizol法所得结果相反，说明高通量测序结果与样品和RNA的提取方法均有关系。采用上述3种方法从酒醅中共检测到2个门、3个纲、4个目、6个科和7个属，每种方法所对应每个分类水平的数量见表2。不同方法对酒醅样品中细菌不同分类水平种属鉴定数量（图3B）及细菌群落Chao1指数（图3C）没有显著差异（P＞0.05），说明上述指标主要是由样品决定的。由图3D可知，微生物群落多样性的趋势为SDS-苯酚法＞Trizol法＞试剂盒法，其中SDS-苯酚法所得Shannon指数显著高于试剂盒法（P＜0.05），说明结合高通量测序分析，SDS-苯酚法所提取的RNA能更好地反映酒醅群落的群落的多样性。在原核微生物纲水平（图4A），SDS-苯酚法和试剂盒法在2种酒醅中提取的纲数量均一致，分别是芽孢杆菌纲（Bacilli）和梭菌纲（Clostridia），而Trizol法除了提取到芽孢杆菌纲和梭菌纲外，在15d酒醅中还提取到γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria），但其相对丰度仅为0.01%。随着发酵时间的延长（图4B），SDS-苯酚法、试剂盒法和Trizol法均表现出芽孢杆菌纲的相对丰度升高，涨幅分别为0.11%、0.05%、0.15%，相反，梭菌纲的相对丰度降低，降幅分别为0.2%、0.05%、0.16%，这可能与酒醅的特性有关，随着发酵过程的进行，芽孢杆菌纲的乳杆菌属作为酒醅微生物群中的优势菌不断增加。结果表明，不同方法提取的纲数量和相对丰度存在一定差异，但基本变化趋势一致。在原核微生物属水平（图5A），两种酒醅共计检测到7个属，分别为乳杆菌属（Lactobacillus）、梭菌属（Clostridium_sensu_stricto_10）、芽孢杆菌属（Bacillus）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）、短小芽孢杆菌（Brevibacillus）、水栖菌属（Enhydrobacter）和类芽孢杆菌属（Paenibacillus），3种方法提取微生物的数量和相对丰度均有一定差异。在7d酒醅中，SDS-苯酚法和试剂盒法均提取到了5个属（图5B、C），Trizol法提取到了4个属（图5D）；在15d酒醅中，SDS-苯酚法、试剂盒法和Trizol法分别提取到了4、6、5个属，其中试剂盒法偏好性地提取到了类芽孢杆菌属，Trizol法偏好性地提取到了水栖菌属，但两者相对丰度均仅为0.01%。随着发酵时间的延长（图5B～D），3种方法所得原核微生物中相对丰度排名前3的乳杆菌属、梭菌属和芽孢杆菌属的变化趋势均一致，乳杆菌属不断增加，梭菌属和芽孢杆菌属则不断下降，这些结果与纲水平上的结果一致。尽管3种方法所得微生物丰度并不完全相同，但3种方法均能反映出两种酒醅原核微生物群之间的差异，并且规律基本一致。
根据UPGMA聚类树分析和PCA结果（图6），Trizol法在反映样本间差异方面的效果最好，SDS-苯酚法次之，试剂盒法则较差。虽然试剂盒法和Trizol法偏好性地提取到了1个属，但其相对丰度过低，不能完全反映其在发酵过程中的变化情况。所以，决定原核微生物群的因素不仅有酒醅类型，提取方法在反映其丰度变化及样本差异方面的影响可能更大。
结论
本研究建立了一种改良的SDS-苯酚法，并比较了其与试剂盒法、Trizol法、CTAB法和月桂酸钠法提取浓香型白酒酒醅总RNA的效果，其中：1）SDS-苯酚法和CTAB法成本较低，试剂盒法耗时最短但成本最高；2）5种总提取方法所得RNA质量浓度为：试剂盒法＞SDS-苯酚法＞Trizol法＞月桂酸钠法＞CTAB法；3）SDS-苯酚法和试剂盒法提取样品总RNA的纯度较高，且SDS-苯酚法电泳条带完整性优于其他方法；4）SDS-苯酚法、试剂盒法和Trizol法所提取的RNA能有效地用于反转录实验及高通量测序分析；5）RNA提取方法及样品特性均会对酒醅微生物群落结构及多样性解析的结果产生不同程度的影响，如SDS-苯酚法获得的微生物多样性明显高于其他两种方法，以及7d和15d酒醅间微生物类群存在差异，且SDS-苯酚法和Trizol法能较好地反映出这种差异。综上所述，本研究系统地比较了5种常见的总RNA提取方法在浓香型酒醅RNA提取的应用效果，其中改良的SDS-苯酚法具有一定的综合优势，为今后以RNA为基础的酒醅分子生物学研究提供了理论依据及方法借鉴。
本文《浓香型白酒酒醅中总RNA提取方法评价》来源于《食品科学》年42卷2期74-82页，作者：胡晓龙，王康丽，宋丽丽，侯建光，曹振华，吴丽丽，牛广杰，马歌丽，赵书民，赵东。DOI:10./spkx---。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
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